高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。鉴于高效液相色谱法在本实验室为最重要的分析检测手段，而药物研发中的很多问题都能从色谱图中得到很好的反映。现结合自身经验和大家实践中可能会经常遇到的一些问题从以下九个方面进行了整理汇总，希望对大家有所帮助。

一、拖尾峰

所谓拖尾峰是指前沿陡峭，后沿较前沿平缓的不对称峰。色谱峰拖尾，是我们在进行色谱实验过程中遇到的最常见问题。按《中国药典》（通则0512高效液相色谱法）要求，通常允许拖尾因子在0.95～1.05之间，因此少量的色谱峰拖尾现象是正常的。但是经常是随着项目的推进，由于色谱柱的老化，峰的拖尾会随着时间而增加。出现拖尾峰的常见原因及解决思路如下：

1、筛板阻塞：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。需要反冲色谱柱，或者更换筛板。

2、色谱柱塌陷：色谱柱塌陷是色谱分析中常见的问题，由柱子老化、柱内压力过大、柱内溶液过浓等原因造成，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。

3、色谱柱未封端：硅羟基与样品作用，加三乙胺，用碱致钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值，纯化样品。使用未封端的色谱柱导致的拖尾峰色谱图见图1，加三乙胺调节pH值后峰型变得尖锐色谱图见图2。

4、死体积或柱外体积过大：将系统中各连接处死体积降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管。

5、柱超载：降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相。

6、色谱柱有污染：更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1小时以上，以冲洗柱子。

7、流动相pH值选择错误：一般化合物以分子状态出峰，离子状态是比较不稳定的。酸性化合物在pH＜pKa-2溶液中以分子状态为主，碱性化合物在pH＞pKa＋2溶液中以分子状态为主。如果流动相pH值选择不合适，就会表现出拖尾。调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，更有利于得到对称峰。

二、前延峰

在反向色谱中色谱峰的前延不如色谱峰的拖尾普遍。与拖尾相同，小幅度的色谱峰的前延是可以接受的。前延峰又称前伸峰、伸舌头峰。前沿平缓，后沿陡峭的不对称色谱峰称前延峰。出现前延峰的可能原因及解决思路如下：

1、样品过载：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前延峰。降低样品含量。

2、样品溶剂选择不恰当：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前延峰，例如，在反相色谱中用乙腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力较弱时会出现前延峰。选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。

3、色谱柱损坏：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。更换色谱柱。色谱柱损坏导致的前延峰色谱图见图3，更换色谱柱后前延峰消失且峰型正常色谱图见图4。

4、流动相梯度不合适：在大峰前有小峰出现，假象前延峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。调整流动相洗脱梯度。

5、柱温：有些样品在常温下分离可见前延峰，提高温度后前延峰的现象消失。

三、峰宽大

宽大峰可能是分裂峰或者扭曲峰的前身。对于新的色谱柱来说，宽峰的塔板数比指定的塔板数要少得多。出现异常宽峰的可能原因及解决思路如下：

1、色谱柱污染或失效，造成塔板数降低：更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。色谱柱污染导致峰宽变宽且变形峰色谱图见图5，更换色谱柱后宽大峰消失且峰型变得尖锐峰色谱图见图6。

2、检测器对反应时间或池体积响应过大：减少响应时间或使用更小的流通池。

3、柱外峰宽效应。一根很好的专用柱用于另一液相色谱系统引起塔板数降低，说明新系统有很大的柱外峰宽效应。

4、发生化学效应，多数是流动相和固定相相互作用所致，改变流动相可使宽峰有所改善。

四、倒峰

通常情况下,色谱峰是从底部向上升的,但是当某些因素影响到色谱柱内的流动相或样品时,就可能出现倒峰现象。 液相色谱倒峰的原因可能有很多,下面列举几个常见的原因：

1、样品折射率小：示差折光检测器测的信号是折射率，出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。

2、密度的原因：密度不一样，出来的峰正倒不一样。

3、进样所致：进样时，样品对原有流动相产生瞬间阻断，然后瞬间涌流，所以产生先倒后高的“溶剂峰”。

4、流动相中含有离子对试剂。流动相使用离子对试剂导致倒峰色谱图见图7。

倒峰基本上不能避免，但试着使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂，另外进样之前注意平衡跟冲洗参比池，这些操作会使倒峰减小一些。

五、裂峰

色谱峰分裂通常是由多种因素引起的，包括色谱柱问题、样品问题、流动相问题以及操作问题等。以下是一些常见的原因及其解决方法：

1、样品复杂：样品基质复杂或分析多种样品，导致柱污染或部分阻塞滤片。通常使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。色谱柱污染裂峰色谱图见图8，使用强极性溶剂冲洗色谱柱后峰型正常色谱图见图9。

2、流动相pH≥7：流动相偏碱性使硅胶溶解，导致柱塌陷。开发新的方法或者选择适合的色谱柱，使用专门的柱子。

3、溶剂比流动相的强度大：可能产生裂峰或宽峰，由样品量决定 （溶剂化效应），解决办法通常是用流动相做溶剂溶解样品。

六、刺峰

刺峰是指窄而尖锐的色谱峰。在使用液相色谱仪时，基线上偶然出现一个或多个尖锐峰，甚至重复出现大量毛刺。显然有些会对结果产生影响，降低精度和准确度，因此需要及时解决。基线出现毛刺的可能原因有很多，下面将为大家介绍常用的解决方法。

1、色谱柱冲洗不彻底：基线出现毛刺时，最简单的方法就是彻底清洗柱子。首先可以尝试用纯水或乙腈等溶剂，进行多次反复洗涤柱子，然后做多次反冲，直至基线稳定。如果清洗无效，可能需要更换柱子。

2、柱子老化或受污染：需要及时更换。同时，要做好柱子的保存工作，避免外部因素对柱子的影响。

3、溶剂影响：溶剂可能也是引起基线产生毛刺的重要原因之一，因此，如果发现基线上的毛刺很多，可以尝试更换溶剂，或者把已有的溶剂再进行一次纯化处理，然后重新使用。

4、进样器：进样器对于液相色谱仪的工作起到了很重要的作用，因此进样器的任何问题都可能会导致基线出现毛刺。因此，需要及时检查进样器的情况，看看是不是需要更换进样器或者清洗进样器等。

对于偶然出现的刺峰，可观察，如不重复出现，可不处理。序列运行过程中重复进样偶然出现的刺峰色谱图见图10、11，同一序列运行过程中重复进样的正常色谱图见图12。

七、基线漂移

基线漂移在梯度洗脱中是很普遍的，A、B溶剂在检测器上的响应差异是造成基线漂移的原因，但是对于异常的基线漂移或者在等度洗脱中出现基线漂移，可能的原因及解决思路如下：

1、室温、柱温波动：即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。使用柱温箱，控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。

2、流动相不均匀：流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。使用HPLC级的溶剂，流动相在使用前进行脱气处理。流动相混合不均匀导致基线波动大色谱图见图13，重新混合流动相并进行脱气处理色谱图见图14。

3、流通池被污染或有气体：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。

4、流动相配比不当或流速变化：更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

5、样品中有强保留的物质：以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

八、基线波动

基线规律的上下起伏称为基线波动。产生基线波动可能的原因及解决思路如下：

1、在流动相、检测器或泵等系统中有空气(尖锐峰)：流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

3、流动相混合不完全：用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂，维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。

4、温度影响(柱温过高，检测器未加热)：使用柱温箱，减少温度差异或加上热交换器。温湿度波动较大导致基线波动大色谱图见图15，严格控制液相室温湿度和柱温色谱图见图16。

5、在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声)：断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。 采用精密级稳压电源。

6、泵振动：在系统中加入脉冲阻尼器。

7、检测器灯能量不足：更换灯。

8、流通池污染：用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池。

9、色谱柱填料流失或阻塞：更换色谱柱或者冲洗色谱柱。

九、分离度不够

1、流动相梯度洗脱设置不合理：优化梯度洗脱程序。流动相梯度洗脱设置不合理色谱图见图17、18，流动相梯度优化后完全分离色谱图见图19。

2、流动相污染或变质(引起保留时间变化)：重新配置流动相。

3、保护柱或分析柱阻塞：去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱；如果分析柱阻塞，可进行反冲；如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序；如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

4、色谱柱选择不合理：可以更换柱效更高例如小粒径的色谱柱。

综上，正确使用色谱柱和选择流动相才是得到好的色谱图的关键。每一个实验室分析人员都应该熟练掌握区分出现异常色谱峰的原因，并对于一些常见的问题分析应该做到游刃有余，才能在实验出现异常的时候及时解决问题，提高工作效率，项目才能顺利推进。